操作步骤
1. 材料处理:
A.动物组织:称取<30mg的组织,加入到1.5ml的离心管中,加入200μl Buffer ML。将样品剪成一块 块小块可以加速裂解效果。
对于组织可使用机械匀浆或者液氮研磨的方式,以提高裂解效果和减少孵育时间。用液氮研磨石,待液氮挥发完后,将粉末转移至的1.5ml离心管中,加入200μl Buffer ML;
B.细胞样品:贴壁培养的细胞要用胰酶(#G0517)处理成细胞悬浮,然后10000rpm离心1min收集细胞,尽量倒弃上清。加入200μl Buffer ML重悬细胞。
2. 加入20μl Proteinase K(20mg/ml),涡旋混匀。
A.细胞样品:加入Proteinase K混匀后,即可继续下一步。
B.动物组织:于55℃水浴孵育至组织完全消化。水浴时每隔20-30min混匀一次。消化时间取决于样品使用量和组织类型,一般需要消化1-3小时,鼠尾等样品也可裂解过夜。
3. 可选步骤:加入5μl Rnase A(用户自备,GBSBIO#P3414)颠倒混匀,在室温条件下孵育5分钟
4. 加入400µl Buffer MB和25µl MagIso Beads,混匀。静置3-5分钟。
5. 转移至磁力架上,静置3~5分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液
6. 加入500ul Buffer MW1,涡旋混匀15秒。转移重悬液到新的离心管中。
7. 转移至磁力架上,静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液
8. 加入600ul 75%乙醇,涡旋混匀15秒。
9. 转移至磁力架上,静置2分钟吸附磁珠。小心吸弃所有溶液
10. 重复第8-9步一次。
11. 短暂离心,收集管壁上的液滴。转移至磁力架上,小心吸弃所有溶液。
12. 空气干燥7~10分钟。
13. 加50~100µl 预热至55oC的Buffer TE或灭菌水等缓冲液,涡旋打散磁珠。静置3~5分钟,其间轻轻振荡1~2次加速DNA溶解。
14. 转移至磁力架上,静置3分钟。转移DNA溶液至新的1.5ml离心管中。